口蹄疫滅活疫苗自誕生以來已使用70多年，實踐證明滅活疫苗可以有效的限制口蹄疫的流行范圍。在與嚴(yán)格的政府防控政策結(jié)合時，甚至可以根除地方性口蹄疫。口蹄疫在亞洲、非洲、歐洲及美洲的許多國家都有發(fā)生，經(jīng)過20世紀(jì)后半葉有效的疫苗預(yù)防接種，歐洲大多數(shù)國家和美洲部分國家都消滅了口蹄疫。目前除歐盟取消了口蹄疫滅活疫苗免疫接種政策外，南美和亞洲多數(shù)國家仍然在使用口蹄疫滅活疫苗預(yù)防和控制口蹄疫。相比新型疫苗，口蹄疫滅活疫苗存在著免疫效果良好、生產(chǎn)工藝成熟等諸多優(yōu)點。但是隨著實踐經(jīng)驗的積累和研究的深入，口蹄疫滅活疫苗的缺點也逐漸為人們熟知。第一，伴隨著口蹄疫滅活疫苗的使用，對疫苗滅活是否徹底的爭議一直在持續(xù)，有報道認(rèn)為部分地區(qū)的口蹄疫流行是由口蹄疫疫苗中病毒滅活不徹底造成。因為懷疑甲醛滅活方法不可靠，人類拋棄了在疫苗生產(chǎn)中最為常用的甲醛滅活法，采用了乙烯亞胺類衍生物滅活法，但乙烯亞胺類衍生物會增加疫苗的毒副作用，最關(guān)鍵的是乙烯亞胺類衍生物對病毒滅活是否徹底依然存在爭議。第二，口蹄疫滅活疫苗的生產(chǎn)過程中存在活病毒增殖以及對實驗動物疫苗免疫后的抗病毒攻擊實驗，這些環(huán)節(jié)稍有不慎就有可能使病毒擴(kuò)散從而造成口蹄疫的流行。雖然按照獸藥GMP的要求以上環(huán)節(jié)都應(yīng)該在負(fù)壓的密閉環(huán)境中進(jìn)行，但病毒粒子的擴(kuò)散是無孔不入的，況且還存在人員的流動，沒有人能夠保證負(fù)壓的密閉環(huán)境一定安全。第三，口蹄疫病毒基因組結(jié)構(gòu)簡單因此非常容易變異，一旦發(fā)生變異，使用原來流行毒株制備的疫苗對變異毒株的保護(hù)能力就會下降。為保持疫苗的保護(hù)力，學(xué)者們需要不斷通過流行病學(xué)調(diào)查分析制苗毒株與流行毒株之間的差異，在差異變大時及時更換制苗毒株，使其與流行毒株相匹配。這給科研單位和疫苗生產(chǎn)企業(yè)增加了巨大的工作負(fù)擔(dān)。基于上述原因，新型疫苗的研發(fā)勢在必行。幾種比較有潛力的新型疫苗的研究進(jìn)展、研究及應(yīng)用情況
合成肽疫苗是以口蹄疫病毒抗原表位的蛋白質(zhì)序列為依據(jù)，用人工方法合成多肽并連接到大分子載體上作為抗原，加入佐劑制備的一類疫苗。20世紀(jì)60—70年代學(xué)者們發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒最重要的抗原決定簇位于VP1上。20世紀(jì)80年代，學(xué)者們開始嘗試使用VP1蛋白作為抗原研制疫苗，實驗證明VP1蛋白免疫動物具有一定效果，但還不足以保護(hù)動物免受口蹄疫強(qiáng)毒攻擊。隨著核酸測序技術(shù)和化學(xué)合成肽技術(shù)的發(fā)展，人們逐步發(fā)現(xiàn)VP1上的多個重要的抗原位點，于是用化學(xué)方法合成了這些抗原位點氨基酸序列并免疫兔子和豚鼠，發(fā)現(xiàn)140～160肽能刺激豚鼠產(chǎn)生高水平中和抗體，并能保護(hù)豚鼠抵抗強(qiáng)毒攻擊。隨后又發(fā)現(xiàn)，200～213氨基酸序列與140～160序列連接時具有更好的免疫效力，于是用這種合成肽制成疫苗，雖然用此疫苗免疫牛之后，其效力明顯低于常規(guī)滅活疫苗，但這種方法開啟了一種新疫苗的研究思路。理想的合成肽應(yīng)該有以下特點：（1）具有良好的免疫原性：研究證明，合成肽具有空間構(gòu)象時能夠提高在實驗動物體內(nèi)的應(yīng)答水平；另外合成肽的抗原表位以二聚體或者多聚體形式存在時，免疫原性比單一表位的合成肽更強(qiáng)。（2）廣泛的免疫交叉性：理想的合成肽疫苗應(yīng)該是一次免疫能夠預(yù)防多種血清型口蹄疫，為實現(xiàn)這一目標(biāo)，Doel等把不同血清型口蹄疫病毒VP1蛋白141～158序列和200～213序列連接起來制成雜合體，實驗證明這種雜合體序列可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗多種血清型的抗體。研究發(fā)現(xiàn)，抗原表面T、B 淋巴細(xì)胞表位的存在，對引發(fā)較高的中和抗體水平有重要意義，而VP1蛋白上的序列同時具有T、B淋巴細(xì)胞表位，因此有學(xué)者將幾個重復(fù)的135～144序列短肽制成疫苗，可以在牛體內(nèi)引發(fā)較高的抗體水平。Chan等將O型口蹄疫病毒VP1蛋白的141～160序列和200～213序列插入豬IgG分子一條重鏈恒定區(qū)，構(gòu)建了一種嵌合體蛋白，這種蛋白在豬和小鼠體內(nèi)都引發(fā)了很好的免疫反應(yīng)。近些年中國在口蹄疫合成肽疫苗的研發(fā)方面取得了很大的成績，中牧實業(yè)股份有限公司與上海申聯(lián)生物醫(yī)藥公司共同研發(fā)了一種將口蹄疫病毒抗原表位與豬IgG重鏈恒定區(qū)連接，并在大腸桿菌中高效表達(dá)的蛋白作為抗原的豬口蹄疫O型合成肽疫苗。用此疫苗連續(xù)免疫豬兩次，抗體陽性率可達(dá)100%，免疫群體可以抗1000ID50的病毒攻擊。豬口蹄疫O型合成肽疫苗已獲得農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的一類新獸藥證書，是國內(nèi)最成功的新型疫苗，目前已經(jīng)開始商品化生產(chǎn)，并逐步在畜牧業(yè)生產(chǎn)中推廣使用。有學(xué)者對豬口蹄疫合成肽疫苗和滅活疫苗的田間使用效果做過比較，合成肽疫苗不論在免疫后的抗體滴度或是在抗強(qiáng)毒保護(hù)方面效果都與滅活疫苗相當(dāng)。相信隨著使用范圍的擴(kuò)大，人們對合成肽疫苗的重視程度將會增加。基因工程亞單位疫苗是指使用基因工程技術(shù)將編碼病原微生物抗原表位的基因?qū)胧荏w菌或者細(xì)胞，使其在受體中高效表達(dá)抗原，然后制備的一類疫苗。Kleid等將口蹄疫抗原基因?qū)氪竽c桿菌成功的表達(dá)了VP1融合蛋白抗原，并用此抗原制備了口蹄疫基因工程亞單位疫苗，在牛和豬體內(nèi)均能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，從此各國科學(xué)家開始廣泛使用這種技術(shù)研發(fā)口蹄疫疫苗。1979年就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)A型口蹄疫病毒空衣殼在豚鼠體內(nèi)的免疫原性與完整病毒粒子相同，而抗空衣殼血清與抗病毒血清也具有相同的特異性，由此開始了空衣殼亞單位疫苗研究。由于空衣殼缺少核酸而僅有蛋白外殼，免疫動物不能產(chǎn)生病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，因此應(yīng)用這種疫苗免疫動物，可以利用現(xiàn)有的診斷病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的血清學(xué)方法，簡便地區(qū)分出免疫動物和感染動物。國內(nèi)外均有研發(fā)空衣殼疫苗的報道，總體來說空衣殼疫苗雖然能提供一定的保護(hù)，但還不能達(dá)到滅活病毒所產(chǎn)生的保護(hù)效果，其主要原因是口蹄疫全病毒衣殼的表達(dá)量不高。隨著基因工程亞單位疫苗的研發(fā)，科學(xué)家逐步總結(jié)出研發(fā)這類疫苗的關(guān)鍵：（1）要鑒定出病毒的主要抗原位點。（2）選用合適的表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)抗原蛋白。最初學(xué)者們普遍采用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗原蛋白，后來發(fā)現(xiàn)原核表達(dá)的抗原蛋白引發(fā)的免疫保護(hù)很低，原因是原核表達(dá)系統(tǒng)對表達(dá)的蛋白進(jìn)行修飾和加工的能力很有限，所以表達(dá)的蛋白常常只有線性表位而缺乏構(gòu)象表位。近幾年真核表達(dá)系統(tǒng)越來越多的用于口蹄疫抗原蛋白的表達(dá)。開始使用較多的是酵母表達(dá)系統(tǒng)，后來發(fā)現(xiàn)昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的蛋白與哺乳動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白無論在結(jié)構(gòu)上還是在免疫原性方面都非常相似，于是學(xué)者們把希望寄托于昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)上。然而昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)對生長環(huán)境要求很嚴(yán)格，需要高溶氧量才能生長，而且不耐機(jī)械攪拌和氣泡沖擊，因此不適于工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)。有報道使用無血清油乳培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的新技術(shù)，不但能提供細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)，而且能夠?qū)?xì)胞形成保護(hù)，這種技術(shù)有可能使昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的大規(guī)模培養(yǎng)成為現(xiàn)實。除了以上的載體系統(tǒng)外，近幾年有一些使用轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)口蹄疫病毒蛋白的報道。Usha等將編碼口蹄疫病毒VP1抗原表位的核酸序列與豇豆花葉病毒（CPMV）的S蛋白基因連接后感染豇豆，此重組體病毒能夠在豇豆細(xì)胞中復(fù)制并表達(dá)融合蛋白，這一試驗揭示了使用植物生產(chǎn)口蹄疫疫苗的可能性。Wigdorovitz等研制出一種能夠表達(dá)口蹄疫病毒VP1蛋白的轉(zhuǎn)基因苜蓿，使用這種苜蓿的提取物免疫小鼠能使小鼠抵抗口蹄疫病毒攻擊，另外還發(fā)現(xiàn)使用苜蓿葉片直接飼喂小鼠，也能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗口蹄疫病毒的特異性免疫反應(yīng)。這一試驗為可飼疫苗的研發(fā)提供了思路。潘麗等將O型口蹄疫病毒P12X-3C 基因成功導(dǎo)入番茄和擬南芥中，該基因在植物種子中能夠特異性表達(dá)，將番茄葉浸出物免疫豚鼠，可產(chǎn)生特異性抗體反應(yīng)，并能抵抗強(qiáng)毒的攻擊。抗原表位又叫做抗原決定簇，是抗原分子中能夠與T細(xì)胞表面受體（TCR）、B細(xì)胞表面受體（BCR）或者抗體分子的抗原結(jié)合片段（Fab）發(fā)生特異性結(jié)合的特殊化學(xué)集團(tuán)，是引起免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)。表位疫苗是利用基因工程方法體外表達(dá)或者人工合成病原微生物的抗原表位，將其作為抗原制成的疫苗。傳統(tǒng)的口蹄疫滅活疫苗主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，而表位疫苗能夠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，并且具有良好的安全性，因此成為口蹄疫疫苗研究中的一個新熱點。研制表位疫苗的前提是篩選出所需的抗原表位。過去使用蛋白質(zhì)降解法確定抗原表位，但這種技術(shù)非常繁瑣，而且只能獲得線性表位而無法獲得構(gòu)象表位。近幾年隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，開始使用噬菌體展示肽庫技術(shù)分析抗原表位，這種技術(shù)可以同時分析線性表位和構(gòu)象表位。另外還有一種使用生物信息學(xué)軟件分析口蹄疫病毒基因組并預(yù)測所有可能的抗原表位，再通過實驗驗證的方法，實踐表明這種方法能夠比較精確的找到T細(xì)胞抗原表位。表位疫苗的抗原只是一段氨基酸殘基，免疫原性很差而且容易被機(jī)體降解，必須與一定的載體連接才能制備疫苗。脂質(zhì)體是常用的表位疫苗載體，將抗原與脂質(zhì)體連接能夠增大抗原的體積，幫助其被抗原遞呈細(xì)胞識別。脂質(zhì)體還具有緩釋劑和佐劑的作用，可以使抗原在體內(nèi)穩(wěn)定長期存在并緩慢釋放的同時增強(qiáng)免疫應(yīng)答。蛋白載體也常常作為表位疫苗的載體使用。乙肝病毒的核心蛋白能夠允許抗原插入其中，并能夠?qū)⑼庠幢砦浑谋┞队诘鞍最w粒表面，因此是常見的蛋白載體。熱休克蛋白也可以作為蛋白載體使用。Bittle等合成了口蹄疫病毒O1K株VP1上的7個短肽，將其分別與KLH蛋白偶聯(lián)后免疫兔子和豚鼠，結(jié)果VP1蛋白141～160位及200～213位的短肽引起機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)免疫應(yīng)答，從此開啟了口蹄疫表位疫苗研究的序幕。理論上講，連續(xù)的重復(fù)性表位肽能誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，Zamorano等將口蹄疫病毒VP1蛋白135～144、135～160短肽制成多聚體后免疫動物均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效價的中和抗體。吳紹強(qiáng)等利用生物信息學(xué)軟件分析了SATⅡ型FMDV可能的抗原表位，并人工合成了８條表位肽，與載體蛋白偶聯(lián)后免疫接種小鼠，檢測結(jié)果表明其中的６條多肽免疫小鼠后能產(chǎn)生抗體。Wang等發(fā)現(xiàn)AsiaI型口蹄疫病毒VP1抗原表位第133～163位氨基酸寡肽具有良好的免疫原性，而用VP2蛋白的第1-33位氨基酸寡肽單獨(dú)免疫不能誘導(dǎo)有效的免疫答, 但能明顯加強(qiáng)VP1表位短肽的免疫原性。該研究表明要研制良好的口蹄疫表位疫苗, 除考慮抗原表位外, 還要尋找與其他結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白表位的聯(lián)合, 這可能有助于開發(fā)免疫原性更強(qiáng)的表位疫苗。Du等用腺病毒表達(dá)體系分別表達(dá)了口蹄疫病毒VP1第21～60位、141～160位和200～213位氨基酸串聯(lián)多表位重組蛋白, 豬α干擾素和豬α-干擾素偶聯(lián)口蹄疫多表位重組蛋白抗原三種蛋白, 并分別免疫豚鼠和豬，結(jié)果顯示豬α-干擾素偶聯(lián)口蹄疫多表位重組蛋白引起體液免疫和細(xì)胞免疫的能力最強(qiáng), 用同源病毒攻擊被免疫動物, 獲得100%保護(hù)。楊亮等選取牛O型口蹄疫病毒VP1蛋白上的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位,將用多種排列方式連接組合，利用計算機(jī)預(yù)測蛋白質(zhì)的3維結(jié)構(gòu)，選取其中最優(yōu)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行構(gòu)建。經(jīng)大腸桿菌表達(dá)重組蛋白后免疫豚鼠后，在豚鼠體內(nèi)誘生了高水平的抗牛O型口蹄疫病毒的抗體。常惠蕓和邵軍軍等利用基因操作、蛋白質(zhì)表達(dá)等相關(guān)技術(shù)研制了針對豬、牛和羊的口蹄疫病毒多表位重組疫苗，該疫苗無論是在實驗動物還是本動物不僅能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的保護(hù)性中和抗體，而且能夠誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖反應(yīng)，具有良好的免疫效果。其中研制的豬O型口蹄疫廣譜多表位疫苗能夠保護(hù)豬只抵抗目前國內(nèi)流行的三個譜系毒株的攻擊，100%保護(hù)。牛的Asia1單價疫苗和Asia1/O型聯(lián)苗能夠保護(hù)免疫豚鼠抵抗同源病毒的攻擊。羊Asia1型口蹄疫多表位疫苗對本動物羊進(jìn)行加強(qiáng)免疫后產(chǎn)生了高水平的保護(hù)性中和抗體。曹軼梅和盧曾軍等用3個不同譜系O型口蹄疫病毒B細(xì)胞表位和通用性T細(xì)胞表位串聯(lián)表達(dá)，加入聚肌胞佐劑，使免疫豬顯著提高了保護(hù)不同譜系強(qiáng)毒攻擊的水平。病毒活載體疫苗是將抗原基因插入載體病毒的特定位置上，然后用載體病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，載體病毒在復(fù)制的同時使抗原基因得到表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物純化后制成的疫苗。近年來，活載體病毒在口蹄疫疫苗研發(fā)中越來越受到重視，原因是病毒活載體疫苗具有諸多優(yōu)點，例如：一個載體病毒中可同時插入多個外源基因，表達(dá)多種病原微生物的抗原，同時起到預(yù)防多種傳染病的作用等。口蹄疫病毒有7種血清型，理論上可以將不同型口蹄疫病毒的抗原基因插入到同一活載體中制成多價疫苗。目前用于表達(dá)口蹄疫病毒抗原的病毒載體主要有痘病毒、腺病毒、桿狀病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、牛鼻氣管炎病毒、牛瘟病毒及煙草花葉病毒等。下面就幾種常見的病毒載體做簡要介紹。痘病毒是第一個用做載體的病毒，也是應(yīng)用最廣泛的載體病毒。痘病毒具有宿主范圍廣、體外培養(yǎng)可以保持較高滴度、不易喪失感染性、基因組容量大且含多個非必需區(qū)等特點，有利于進(jìn)行基因工程操作，而且插入多個外源基因還能保持抗原性穩(wěn)定和免疫原性。研究發(fā)現(xiàn)重組痘病毒接種豚鼠能同時引發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫。Berinstein等構(gòu)建了表達(dá)口蹄疫病毒P1基因的重組痘病毒，用此重組痘病毒接種Balb/c小鼠后用ELISA 檢測出高滴度的口蹄疫病毒抗體，并能使小鼠獲得抗同源病毒攻擊的能力。Zheng等用雞痘病毒作載體構(gòu)建了表達(dá)口蹄疫病毒P1-2A和3C基因的重組疫苗，在小鼠和豚鼠免疫試驗均表現(xiàn)出較好的免疫效果，并且在豚鼠攻毒試驗中，可抵抗同源病毒攻毒。金明蘭等將口蹄疫病毒衣殼蛋白前體P1-2A 基因和蛋白酶3C 基因插入雞痘病毒表達(dá)載體中，構(gòu)建重組雞痘病毒，免疫小鼠后，可產(chǎn)生較高水平的特異性抗體。Ma等將口蹄疫病毒的衣殼蛋白P12A 基因、3C編碼區(qū)基因、豬白細(xì)胞介素18基因等導(dǎo)入雞痘病毒基因組中，免疫動物后，可產(chǎn)生對O型FMDV的部分保護(hù)作用。痘病毒能夠感染多種動物，在一些體弱動物會引起比較強(qiáng)烈的病理反應(yīng)，還能通過接觸傳播，這在一定程度上阻礙了其作為載體的相關(guān)研究。2007年，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所張強(qiáng)將中國應(yīng)用廣泛的山羊痘疫苗弱毒株（AV41）改造為一個痘病毒載體，表達(dá)口蹄疫病毒P1-2A3C基因獲得成功，為反芻動物活載體疫苗的研究提供了新的思路。人腺病毒是表達(dá)外源基因的常用載體。腺病毒可在多種細(xì)胞上生長，外源蛋白表達(dá)量高，另外腺病毒基因以附著體形式長期存在于機(jī)體內(nèi)，在此期間外源基因可以不斷地表達(dá)，從而延長對機(jī)體的免疫刺激，達(dá)到更好的免疫效果。Sanz等用人IV型腺病毒疫苗株（Ad5 wt）載體，構(gòu)建了表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白P1基因的重組腺病毒活載體疫苗Ad5-P1。用Ad5 wt和重組的Ad5-P1混合后經(jīng)皮下或鼻內(nèi)接種牛，在第二次免疫后滴鼻感染口蹄疫病毒，牛得到有效的保護(hù)。Mayr等構(gòu)建了表達(dá)口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白的VI型腺病毒并制成疫苗，間隔4周用相同劑量免疫豬群兩次，可使豬群產(chǎn)生高水平的口蹄疫病毒中和抗體，80%以上免疫豬得到完全保護(hù)。Du等將口蹄疫病毒P1基因和豬的干擾素基因同時插入人腺病毒基因中，構(gòu)建了重組腺病毒，免疫豚鼠后可產(chǎn)生高水平的中和抗體，并可保護(hù)豚鼠免受O型口蹄疫病毒的攻擊。桿狀病毒（Baculovirus）是昆蟲病毒，具有以下主要優(yōu)點：（1）病毒基因組較大，可以同時表達(dá)多個外源基因；（2）桿狀病毒不感染動物細(xì)胞，因此遺傳學(xué)上是安全的表達(dá)載體；（3）昆蟲細(xì)胞屬于真核細(xì)胞，能夠?qū)Ρ磉_(dá)產(chǎn)物加工修飾，因此絕大部分外源基因表達(dá)產(chǎn)物均有良好的生物活性；（4）啟動子強(qiáng)，外源基因可得到較高表達(dá)。1993年美國梅島動物疾病研究中心用桿狀病毒表達(dá)口蹄疫病毒的P1蛋白及部分P2蛋白和P3蛋白，免疫豬群后能使部分豬獲得抗強(qiáng)毒攻擊保護(hù)力。2008年，柳紀(jì)省等用家蠶桿狀病毒表達(dá)體系表達(dá)了口蹄疫病毒Asia1型空衣殼抗原,家蠶桿狀病毒載體在蠶體內(nèi)復(fù)制時表達(dá)的口蹄疫病毒抗原蛋白經(jīng)過修飾，在理化性質(zhì)和免疫學(xué)活性等方面與口蹄疫病毒粒子的衣殼蛋白相似。用這種桿狀病毒去掉核酸制成的空衣殼沒有感染性，但可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，是理想的制苗抗原。核酸疫苗也稱基因疫苗，是把外源的抗原基因克隆到質(zhì)粒上，然后將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)，使外源基因在動物體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生蛋白抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的疫苗。從理論上講核酸疫苗成本低、免疫期長，又易于設(shè)計和構(gòu)建，因此被稱為免疫學(xué)上的第三次革命。最初構(gòu)建的口蹄疫核酸疫苗是包含A12株cDNA全基因組的pWRM質(zhì)粒，但全基因組在表達(dá)時有可能會產(chǎn)生活病毒，因此在之后的研究中通常只構(gòu)建表達(dá)抗原表位的核酸疫苗，而最常表達(dá)的抗原表位仍舊是衣殼蛋白VP1上的140～160及200～213氨基酸序列，但實踐證明這些表位引發(fā)的免疫反應(yīng)很弱。之后學(xué)者們開始把衣殼蛋白編碼區(qū)基因與非編碼區(qū)基因共同構(gòu)建同一質(zhì)粒，以期產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。Benvenisti將口蹄疫病毒完整的衣殼蛋白基因P1和非結(jié)構(gòu)蛋白基因2A、3CD 串聯(lián)起來，同時加入心肌炎病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)，構(gòu)建核酸疫苗并注射到豬皮膚中，部分豬可以抵抗口蹄疫病毒強(qiáng)毒的攻擊。Shieh 等為增強(qiáng)免疫效果將核酸疫苗和亞單位疫苗聯(lián)合使用，具體方法是首先用含有口蹄疫病毒VP1基因的質(zhì)粒免疫小鼠，再用VP1蛋白抗原二疫，小鼠產(chǎn)生了高效價的中和抗體。因IgG在宿主體內(nèi)有較長的生命周期，與IgG分子融合能夠延長VP1抗原的半衰期，理論上能使宿主持續(xù)受到刺激，引發(fā)更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，Wong 等分別構(gòu)建了兩種編碼口蹄疫病毒VP1兩個抗原位點141～160、200～213氨基酸序列及豬、小鼠免疫球蛋白IgG恒定區(qū)的質(zhì)粒。用這兩種質(zhì)粒分別免疫豬和小鼠，在小鼠同時引發(fā)了體液免疫和細(xì)胞免疫，豬獲得了抗強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)力。基因工程技術(shù)的發(fā)展，使得人為突變病毒基因組或刪除病毒某一蛋白編碼區(qū)成為現(xiàn)實，因此基因缺失疫苗應(yīng)運(yùn)而生。基因缺失疫苗是使用基因工程技術(shù)把病毒強(qiáng)毒株中與毒力相關(guān)的基因切除，使其成為弱毒或者無毒的毒株，然后制成的活疫苗。基因缺失疫苗具有安全性好、毒力不易反強(qiáng)、注射疫苗后機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答與強(qiáng)毒感染幾乎完全一致等諸多優(yōu)點而得到很多學(xué)者的重視。另外還可將切除的毒力基因表達(dá)后制成診斷試劑，從而區(qū)分免疫動物和自然感染動物。McKenna等使用基因工程技術(shù)獲得了一株刪除VP1基因上的RGD受體結(jié)合位點的口蹄疫病毒A12，將此毒株接種豬和乳鼠都不致病，接種牛不會引發(fā)任何癥狀，但可以產(chǎn)生高水平的中和抗體，并對病毒攻擊能產(chǎn)生保護(hù)力。Chinsangaram 等構(gòu)建了一株L蛋白酶基因缺失的A12 型口蹄疫病毒，該毒株可以在BHK-21細(xì)胞中正常增殖，在接種乳鼠之后無明顯癥狀而且不會在個體間傳播，接種牛和豬能快速引發(fā)免疫反應(yīng)，而且產(chǎn)生的保護(hù)力與滅活疫苗相似。這一毒株的L蛋白酶基因缺失使其毒力反強(qiáng)的可能性大大下降，而又具有無毒力并且不會在動物間傳播的特性，所以不論做滅活疫苗或者活疫苗都很適合。口蹄疫滅活疫苗免疫后動物經(jīng)常出現(xiàn)隱形感染和持續(xù)帶毒的情況，一般認(rèn)為滅活疫苗中除去了絕大多數(shù)非結(jié)構(gòu)蛋白，免疫動物幾乎不產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，而感染動物體內(nèi)具有非結(jié)構(gòu)蛋白抗體。因此經(jīng)常使用檢測血清中非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的方法區(qū)分疫苗免疫動物中的感染動物。新型疫苗出現(xiàn)后面臨著與滅活疫苗同樣的問題，為了便于在實驗室診斷中能夠區(qū)分疫苗免疫動物和感染動物，近年來出現(xiàn)了一些能夠進(jìn)行鑒別診斷的標(biāo)記疫苗。口蹄疫標(biāo)記疫苗，是缺失了病毒某段致病相關(guān)基因或優(yōu)勢表位基因的弱毒苗或滅活苗。該類疫苗保持了弱毒苗或滅活苗免疫效力最優(yōu)的特性，且消除了常規(guī)疫苗多次免疫干擾鑒別診斷缺陷。利用反向遺傳操作技術(shù)，即可有目的的缺失基因，構(gòu)建標(biāo)記病毒，同時也可修飾抗原表位基因，拓展病毒抗原譜。在研發(fā)標(biāo)記疫苗的同時，也要研發(fā)相應(yīng)的鑒別診斷技術(shù)。只有鑒別診斷成熟的新型疫苗才能叫做標(biāo)記疫苗。劉在新等已完成口蹄疫O型標(biāo)記滅活疫苗的實驗室研究，進(jìn)入了臨床試驗階段。理論上講新型疫苗都能夠開發(fā)成為標(biāo)記疫苗，關(guān)鍵的問題是如何選擇與之配合的鑒別診斷技術(shù)。常用的鑒別診斷技術(shù)有很多種，與口蹄疫標(biāo)記疫苗相配合的診斷技術(shù)主要有基于單克隆抗體和重組抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、基因芯片(Gene Chip)技術(shù)和生物傳感技術(shù)。ELISA通過檢驗疫苗中獨(dú)特的蛋白標(biāo)記物的特異性抗體來做鑒別診斷。而RT-PCR技術(shù)通過擴(kuò)增并直接檢測口蹄疫病毒的基因來做鑒別診斷。基因芯片(Gene Chip)是分子生物學(xué)與電子芯片融合的技術(shù)，首先設(shè)計與被檢測基因序列互補(bǔ)的探針, 并將其固定于固相載體(如硅片、玻璃、塑料等)表面形成陣列，與被檢測物發(fā)生反應(yīng)后將信號傳導(dǎo)給計算機(jī)，通過專用軟件分析可快速、準(zhǔn)確地做出診斷。基因芯片技術(shù)具有快速、微量、準(zhǔn)確等優(yōu)點,已逐漸發(fā)展成為新型診斷方法。生物傳感技術(shù)是將特異性抗體等與口蹄疫相關(guān)的生物學(xué)作用轉(zhuǎn)換為可測量信號，然后對這種信號進(jìn)行檢測的技術(shù)。信號轉(zhuǎn)換技術(shù)包括電化學(xué)測定法、反射測定法、干擾測定法、共振測定法及熒光測定法等。由于設(shè)備成本高、單個樣品分析昂貴，并且需要經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)的人員來進(jìn)行操作，因此生物傳感技術(shù)目前僅用于科研方面。病毒樣顆粒（Virus like particles，VLPs）是含有某種病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，沒有病毒的核酸，不能自主復(fù)制，沒有感染性，其結(jié)構(gòu)與病毒相似，可以通過與病毒相同的途徑傳遞給免疫細(xì)胞，并有效的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，多數(shù)病毒衣殼蛋白基因都已經(jīng)能夠在表達(dá)系統(tǒng)中有效表達(dá)并自我組裝，這為病毒樣顆粒疫苗的研發(fā)提供了便利條件。病毒樣顆粒在人用疫苗的研究非常廣泛，并已有商品疫苗投入市場，但在獸用疫苗領(lǐng)域開始相關(guān)研究的時間較短。口蹄疫病毒樣顆粒的研究方面，孫世琪等用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了口蹄疫衣殼蛋白VP0、VP3和嵌合型VP1在體外組裝出嵌合型FLAG外源多肽口蹄疫病毒樣顆粒，外源蛋白的插入沒有影響病毒樣顆粒的空間結(jié)構(gòu)，這項研究為口蹄疫病毒樣顆粒疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。郭慧琛等利用泛素化原核系統(tǒng)，研制的VLPs疫苗效力與滅活苗相當(dāng)，達(dá)到了OIE和中國的口蹄疫疫苗要求標(biāo)準(zhǔn)。周國輝等將Asia1型口蹄疫病毒的Asia1/YS/CHA/05毒株的感染性cDNA序列在體外拼接亞基因組，然后將其克隆入人缺損腺病毒5型，病毒在復(fù)制的過程中能夠形成口蹄疫病毒樣顆粒并在病毒傳代過程中穩(wěn)定表達(dá)。用這種表達(dá)Asia1型口蹄疫病毒樣顆粒的重組腺病毒免疫小鼠，可誘導(dǎo)高水平中和抗體，并能持續(xù)較長時間。口蹄疫病毒樣顆粒具有活病毒的很多免疫學(xué)活性，但是沒有感染性，穩(wěn)定性好，不易失活，因此口蹄疫病毒樣顆粒疫苗具有關(guān)闊的發(fā)展前景。近年來反向遺傳學(xué)技術(shù)為研究病毒的基因結(jié)構(gòu)與功能，病毒復(fù)制與表達(dá)調(diào)控機(jī)理等提供了有效的方法，與此同時，也為反向遺傳疫苗的研究開創(chuàng)了一片新天地。反向遺傳疫苗是通過反向遺傳技術(shù)實現(xiàn)對病毒基因的改造和修飾，獲得預(yù)期生物特性的毒株，以提高生產(chǎn)性能、抗原匹配性、免疫應(yīng)答能力和生物安全性等特征，用這種毒株制備的疫苗。Fowler等將O1BFS和C3RES的VP1 G-H的130～157位點替換A12毒株相應(yīng)位點，并制備了單價疫苗，動物實驗顯示該疫苗能夠?qū)ε：拓i后發(fā)現(xiàn)等抵抗強(qiáng)度強(qiáng)毒攻擊。鄭海學(xué)等用反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建疫苗種毒Re-A/WH/09株及成功研制疫苗，解決了田間毒株產(chǎn)量低、抗原不穩(wěn)定不適作為種毒的難題，將Re-A/WH/09與Asia1型和O型疫苗種毒組合，研制出口蹄疫三價滅活疫苗。該疫苗對各流行毒的PD50均≥9.0，高于OIE推薦的常規(guī)疫苗≥3個PD50、緊急免疫接種疫苗≥6個PD50的國際標(biāo)準(zhǔn)。李平花等以O(shè)/HN/93疫苗毒株的感染性克隆為骨架，用新豬毒系病毒的部分VP3和VP1基因替換疫苗毒株的相應(yīng)部分，構(gòu)建了嵌合的FMDV全長cDNA克隆。該嵌合病毒的成功拯救為口蹄疫嵌合疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。Segundo等利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建的Sap突變株表現(xiàn)對BHK-21細(xì)胞較高的滴度，而對豬沒有臨床癥狀、無血毒癥和無排毒等現(xiàn)象，而且SAP突變株接種動物引起較強(qiáng)的中和抗體反應(yīng)，并能夠產(chǎn)生早期免疫的全保護(hù)，具有發(fā)展為無致病疫苗株的潛力。Belinda Blignaut等通過在SAT1型病毒株KNP/196/91的感染性cDNA克隆中編碼外部衣殼蛋白的區(qū)域（1B-1D/2A）替換SAT2型疫苗株ZIM/7/83相應(yīng)位點，構(gòu)建了型交叉的嵌合病毒,將親本毒和嵌合毒制備的疫苗分別接種豚鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生相似的抗體反應(yīng)，之后又用該嵌合病毒接種豬后也能夠產(chǎn)生中和抗體并能抵抗同源病毒的攻擊。反向遺傳技術(shù)雖然有諸多優(yōu)點，為新疫苗的研發(fā)開辟了一條新途徑，但也應(yīng)看到這種研究存在的生物安全風(fēng)險，研究人員在實驗設(shè)計中應(yīng)當(dāng)考慮到如何避免病毒毒力返強(qiáng)的問題。基因工程技術(shù)的發(fā)展為新型疫苗研發(fā)提供了思路，目前正在研發(fā)的新型疫苗有很多種，本文介紹的都是近幾年研究較多而且有一定應(yīng)用前景的新型疫苗。新型疫苗相比滅活疫苗在安全性上更有優(yōu)勢，可根據(jù)需要制備同一病毒多個成分或多價病毒疫苗，而且大幅度降低生產(chǎn)成本等優(yōu)點，因此是未來發(fā)展的方向。但新型疫苗在免疫效果方面往往不夠理想，原因是新型疫苗普遍存在抗原位點少、抗原純度高或者抗原分子量小等問題，因此常常不能誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。隨著生物工程技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，新型疫苗存在的這些問題必將會一一得到解決,相信新型疫苗在未來會取得重大突破。（李冬，劉在新）*此章節(jié)內(nèi)容摘錄來源于動物疫病防控出版工程叢書《口蹄疫》，讀者朋友若購買此書及了解其他相關(guān)信息歡迎登陸中國農(nóng)業(yè)出版社網(wǎng)站www.ccap.com.cn
