?陳同煜1，寧慧波2，彭濤1，王玉超1，古金元1，胡東方1，劉思當1
1.山東農業大學動物科技學院；2.海博萊生物科技咨詢（北京）有限公司

　　副豬嗜血桿菌所引起的副豬嗜血桿菌病是嚴重危害養豬業健康發展的一種重要細菌性疾病。近年來，由于早期斷奶方案和保育圈高密度飼養特性，造成副豬嗜血桿菌病在保育仔豬階段呈高發態勢。另一方面，一些病毒性疾病如豬圓環病毒病、藍耳病、偽狂犬病、豬流感、豬瘟等病毒病的流行造成豬群免疫力低下，也為副豬嗜血桿菌的感染提供了可乘之機，尤其是藍耳病病毒和圓環病毒2型與副豬嗜血桿菌混合感染的病例顯著增加。大量臨床資料證實，完善病毒性疾病的免疫防控和應用合理的藥物防治措施可顯著降低該病的發病死亡率。但進入中后期的病例則抗生素治療效果較差，也可以說已不可治愈。所以該病的平時預防和早期確診及敏感藥物的前期治療尤為重要，現介紹一起山東省泰安地區某規?；i場副豬嗜血桿菌病典型病例的診斷與防治。
　　1　背景
　　山東省泰安市某規?；苑弊责B豬場現有存欄母豬80頭，保育豬400頭。2016年11月5日發現該豬場20余頭40日齡左右的保育豬出現高熱（40.5℃～42℃），精神沉郁，食欲不振，咳嗽、氣碶-、呼吸困難，部分病豬體表被毛粗亂，消瘦跛行，伴有腹瀉等臨床癥狀。豬場獸醫對病豬注射了板藍根針劑，并投服替米考星、微生態制劑類藥物，效果欠佳；病豬1周左右死亡，疫情逐步擴大，一周后保育舍發病率20%，死亡率達60%，遂前來就診。
　　2　綜合診斷
　　2.1　臨床檢查
　　送檢病豬主要表現后肢關節腫脹，無法站立，呈“犬”坐姿勢；精神沉郁，呼吸極度困難，咳嗽、氣碶-；眼瞼腫脹，耳朵及腹部皮膚呈紫紅色，耳尖發紺，其他未見明顯異常。
　　2.2　剖檢病變
　　對送檢病豬頸動脈放血致死，剖檢發現病豬下頜與腹股溝淋巴結出血腫大（圖1-A）；胸、腹腔大量積液（圖1-B、圖1-C）；胸腹膜、心、肺、肝、脾、腸道、膀胱等組織器官表面纖維素滲出并造成不同程度的黏連（圖1-D、圖1-E）；肺臟暗紅色腫大，觸之有實變；肝臟淤血腫大；腦膜充血水腫（圖1-F），其他未見明顯異常。

圖1　病豬剖檢病變

2.3　組織病理學病變
　　對剖檢豬的腦、肺、肝、脾、淋巴結及扁桃體取樣，10%中性福爾馬林溶液固定，常規石蠟切片，HE染色，鏡檢?？梢姷湫突撔阅X膜炎病變，腦膜血管充血、出血，周圍有大量中性粒細胞浸潤（見圖2-A、圖2-B）；肺泡壁毛細血管充血，肺泡腔和支氣管內有大量中性粒細胞浸潤（見圖2-C、圖2-D）；肝臟淤血，肝竇增寬，被膜表面有纖維素性滲出物及炎性細胞（見圖2-E、圖2-F）；脾臟充血，纖維素性滲出區域充滿大量中性粒細胞，并可見炎性細胞壞死崩解（見圖2-G）；扁桃體毛細血管充血，隱窩擴張，內含漿液及中性白細胞（見圖2-H）；淋巴結被膜、小梁及實質中毛細血管充血，水腫，呈漿液性淋巴結炎病變（見圖2-I、圖2-J）。

圖2　病豬組織病理學變化

圖3　分離菌株革蘭氏染色（1000×）

2.4　細菌分離培養及鑒定
　　采集肺組織劃線接種于含新生牛血清（終濃度10%）和NAD（終濃度20g/ml）的TSA培養基上，37℃培養24h～48h后挑取疑似菌落進行傳代純化，培養24h～48h后可見針尖大小、無色透明、光滑濕潤的菌落形態。革蘭氏染色鏡檢，觀察到菌體呈革蘭氏陰性細小桿菌，有多種不同形態，從單個球桿菌到細絲桿菌不等（圖3）。同時，挑取細小單菌落接種于含新生牛血清（終濃度10%）和NAD（終濃度20g/ml）的TSB液體培養基中進行增菌，37℃、12h后挑取菌液進行PCR鑒定。根據GenBank公布的序列設計副豬嗜血桿菌（HPS）的特異性引物（見表1，綷-驗證均具有較好的特異性和擴增效率），用PCR/RT-PCR方法擴增后，將擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，紫外凝膠成像儀下根據條帶位置判定病豬的病原感染狀況（圖4）。

表1　PCR/RT-PCR引物序列

注：M為DL 2000 Marker；+為陽性對照；S為檢測樣品。

圖4　1.5%瓊脂糖凝膠電泳

2.5　生化鑒定
　　將分離純化得到的疑似菌落分別接種于H2S、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、木糖、甘露醇、脲酶、觸酶、氧化酶、吲哚、硝酸鹽微量生化鑒定管中，每支生化管中同時加入1μL犢牛血清和1μL NAD的（V因子），置于37℃恒溫培養箱，培養24h～48h，觀察結果（見表2）。其中H2S、木糖、甘露醇、脲酶、氧化酶、吲哚反應呈陰性，葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、觸酶、硝酸鹽反應呈陽性，符合副豬嗜血桿菌生化特性。

表2　生化特性培養結果

注：“+”代表陽性，“-”代表陰性。
　　2.6　藥物敏感試驗
　　用滅菌接種環挑取純化菌落均勻涂布于一新鮮含NAD及犢牛血清的TSA平板上，然后用無菌鑷子將藥敏片（每片含量5μg）按一定間隔分別平貼于培養基表面，于37℃ CO2培養箱中培養24h，根據抑菌圈直徑（φ）判定細菌對藥物的敏感程度。判定標準為：φ≥25mm為極度敏感；15mm≤φ＜25mm為高度敏感；10mm≤φ＜15mm為中度敏感；φ＜10mm為低度敏感；無抑菌圈則為耐藥。結果顯示，頭孢噻呋鈉、強力霉素和恩諾沙星高敏，慶大霉素、阿莫西林和四環素中度敏感，氟苯尼考低敏，林可霉素、青霉素不敏感。
　　3　結論
　　結合該豬場發病豬流行病學、臨床癥狀、剖檢病變及上述相關實驗室檢測，確定本次疫情為副豬嗜血桿菌感染所致。
　　4　防控
　　研究發現，各地分離到的副豬嗜血桿菌的血清型復雜多樣，按Kieletein和Rapp-Uabr-iedSon瓊脂擴散血清分型方法，至少可將副豬嗜血桿菌分為15個血清型，另有20%以上的分離株不能定型，各型之間交叉保護力弱。目前市面流通的副豬嗜血桿菌油乳滅活疫苗所含血清型各有差異，并不能對某區域流行的副豬嗜血桿菌提供特異性保護，當發生副豬嗜血桿菌病時，首先需對病原菌進行分離及血清鑒定分型，明確該區域內流行的主要血清型，然后選擇合適的疫苗對發病豬群進行疫苗免疫。另外，對病情較重的中小規模豬場適宜抗生素的應用可能更為行之有效。但隨著抗生素的大量使用，該菌對常用抗生素的耐藥性越來越高，且不同地區不同副豬嗜血桿菌菌株敏感藥物各不相同，因此需分離病原菌進行藥敏試驗，篩查敏感藥物以進行有效防控。試驗證明，該病例分離菌株對頭孢噻呋鈉、強力霉素、恩諾沙星高度敏感，在此基礎上提出了防治方案。
　　4.1　隔離病豬
　　為避免交互感染，及時挑離發病豬只，單獨隔離飼養，對發病嚴重且無治療價值豬只及時淘蘚-。
　　4.2　衛生消毒
　　徹底清理發病豬舍衛生，尤其注意對豬舍空氣及飼養環境的消毒，可采用火焰噴燈噴射豬舍地面及墻壁，并加強料槽、水槽等用具的洗刷消毒。
　　4.3　藥物保健程序
　　對該病的治療需早發現、早診斷、早治療，并篩選敏感藥物對癥治療。
　　對發病嚴重豬只應用頭孢噻呋注射液，5mg/kg，肌肉注射，每日1次，連用5d；病豬群用強力霉素20g/100kg水，連續飲水5d。
　　整體保育豬群斷奶后1d～5d，強力霉素20g/100kg飼料，水溶解噴灑顆粒料，連用5d；斷奶后11d～15d，包被恩諾沙星20g/100kg飼料拌料，連用5d。
　　保育圈仔豬飼料中添加維生素C或黃芪多糖，提高機體抵抗力，減少應激反應。
　　4.4　加強飼養管理
　　降低豬只飼養密度，改善豬舍通風環境，定期衛生消毒，保持圈舍清潔干燥。
　　通過實施以上綜合防控措施，使該豬場保育豬副豬嗜血桿菌病得到了有效控制，豬場逐步恢復穩定生產。
　　劉思當 Email：liusid@sdau.edu.cn