鄒盼盼1，王春江2，曹省艷3

楊陽1，王邁4，齊雪峰1

(1.西北農林科技大學動物醫學院，陜西楊凌 712100；2.河北威遠藥業有限公司，河北石家莊 050000；3.綿陽市動物疾病預防控制中心，四川綿陽 621000；4.石家莊市農業綜合行政執法支隊，河北石家莊 050000)

在生豬養殖業中，仔豬出生后 3~5 周實施斷奶極易產生應激反應，主要表現為精神萎靡、食欲不振、腹瀉或者其他腸道疾病，甚至導致死亡[1]。隨著集約化養殖的發展，雖然生產實踐中通過在日糧中添加抗生素可有效改善仔豬斷奶應激，但長期使用抗生素會蓄積于動物體內，并且殘留在各種動物性食品中，威脅食品安全且污染環境。除此之外,還會產生細菌耐藥性問題，形成惡性循環[2]。我國于2020年7月禁止一切抗生素藥物應用于飼料添加劑。因此，探尋綠色、高效的抗生素替代產品對我國養豬產業健康可持續發展具有重要意義[3]。現廣泛應用的抗生素替代藥物有植物提取物^[4]、酸化劑[5]、酶制劑[6]等。植物精油(plant essential oils,PEO)是從各種植物中提取的具有抑(殺)菌、抗炎、抗氧化等作用的活性物質。目前在畜牧業上應用最為廣泛的 PEO 有 3 種，分別為百里香酚、香芹酚和肉桂醛，其中百里香酚主要來源于百里香、牛至，香芹酚主要來源于中草藥牛至，肉桂醛是中藥肉桂的主要活性成分[7-9]。

有研究指出，在斷奶仔豬基礎日糧中添加250 mg/kg的百里香酚和香芹酚，能顯著提高斷奶仔豬的生長性能和對營養物質消化吸收的能力[10]。但也有不同研究結果指出,在斷奶仔豬基礎日糧中添加 500 mg/kg 百里香酚或者 18 mg/kg 的百里香酚和肉桂醛均不能顯著提高仔豬的生長性能，但能顯著提高仔豬免疫能力，降低腹瀉率[11-12]。由此可見,不同種類的植物精油、不同添加水平,對斷奶仔豬的效果也不同。此外，有研究表明，在畜禽日糧中添加牛至精油(有效成分為百里香酚和香芹酚)能改善仔豬腸道菌群結構[13]。在早期斷奶仔豬日糧中添加 0.3%肉桂醛或 0.5%香聲酚，均能提高仔豬腸道內乳酸桿菌的豐度，降低腸桿菌的含量，降低仔豬腹瀉率[14-15]。

在無抗養殖背景下，傳統中藥在養殖領城逐漸為人們所接受，PEO 作為替抗產品受到越來越多的關注，然而現有的文獻支持以單體精油為多，對復合植物精油在畜禽生產上的研究偏少。因此，為推廣復合植物精油在養豬產業的合理應用，本研究選用由百里香酚、香芹酚和肉桂醛配制的復合植物精油為研究對象，將其添加到斷奶仔豬日糧中，探究其對斷奶仔豬作用60d后，對仔豬生長性能和腸道結構的影響。

1.1 材料

1.1.1 復合精油主要成分  百里香酚、肉桂醛、香芹酚三者配比為 1:1:1。

1.1.2 主要試劑  百里香酚、肉桂醛、香芹酚，河北威遠藥業有限公司產品；10%福爾馬林、HE 染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司產品；無水乙醇，成都市科隆化學品有限公司；二甲苯，廣東省化學試劑工程技術研究開發中心產品；DNA 抽提試劑盒(E.Z.N.A.?Soil DNA Kit)，美國Omega Bio-Tek公司產品；瓊脂糖(biowest agArose)，西班牙biowest公司產品；FastPfu Polymerase，中國 TransGen 公司產品；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit ( Axygen Biosciences)，美國Axygen公司產品；建庫試劑盒(NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit)，美國 Bioo Scientific 公司產品；測序試劑盒(MiSeq ReagentKit v3/NovaSeq Reagent Kits)，美國 Illumina 公司產品。

1.1.3 主要儀器  移液器(Eppendorf N13462C)、小型離心機(Eppendorf 5430 R)、高速臺式離心機(Eppendorf 5424R)，德國 Eppendorf 公司產品；小型離心機(ABSON MiFly-6)，合肥艾本森科學儀器有限公司產品;超微量分光光度計(NanoDrop2000),美國Thermo Fisher Scientific 公司產品；酶標儀(BioTek ELx800)，美國 Biotek 公司產品；旋渦混合器(QL-901)，海門其林貝爾儀器制造有限公司產品；粉碎研磨儀(TL-48R)，上海萬柏生物科技有限公司產品；電泳儀(DYY-6C)，北京六生物科技有限公司產品; PCR 儀(ABI Gene-Amp@ 9700 型),美國 ABI 公司產品;測序(Illumina Miseg),美國 Illumina 公司產品；正置顯微鏡(Ni-U)，日本尼康公司產品；超薄切片機(EMUC7)，奧地利徠卡儀器有限公司產品;

1.2 方法

1.2.1 試驗設計與飼養管理  選用 22 日齡斷奶、體重相近的大白×長白×杜洛克三元雜交閹公豬，隨機分為兩組，每組10頭，群欄飼養。對照組和試驗組分別飼喂基礎日糧和添加復合植物精油的試驗日糧，添加量為500 mg/kg。各組均處于同一飼養條件下，預試驗7d，正式試驗期為60d，由專業人員進行飼養并定期記錄試驗數據，試驗期內全部試驗仔豬飲水采食自由，正常免疫，定期對豬舍進行消毒。

1.2.2 試驗日糧  基礎日糧參照中國瘦肉型生長豬飼養標準(2004)配制。

1.2.3 生長性能  分別于試驗正式開始和結束時對每組仔豬空腹稱重,記錄初重、末重、日采食量，計算平均日采食量(average daily feed intake,ADFI)、平均日增重(average daily gain,ADG)、料重比(F/G)。同時記錄每欄每天仔豬腹瀉頭數和死亡情況，計算仔豬腹瀉率。

1.2.4 腸道樣品采集與處理  于試驗結束時，每組隨機選擇 4 頭仔豬，屠宰后，打開腹腔分離腸道，暴露直腸，在骨盆腔中單結扎，取出全部腸道。再按十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸等不同腸段分別進行兩端結扎并分離各段消化道。然后用滅菌剪刀從腸道各段截取約 2 cm X 2 cm(各腸段分別采集 2~3份作為試驗和備份)，用無菌生理鹽水將上述組織內壁輕輕沖洗干凈，至內壁沒有肉眼可見的黏附內容物為止，放入10%福爾馬林密封編號后保存。

用滅菌醫用剪刀從十二指腸、直腸中部剪開一個小口，再用滅菌藥勺挖取大約 2 g 內容物分裝到已滅菌的 2 mL凍存管中(各腸段分別采集 2~3 份作為試驗和備份),編號、旋緊螺蓋后迅速放入液氮或一80C超低溫冰箱中保存待用。

1.2.5  腸道長度的測量與腸道組織蘇木精-伊紅染色  將完整取出來的腸道放到試驗臺，及時測量腸道長度。然后將固定的腸組織取出，參照常用的實驗方法來制作石蠟切片,試驗步驟包括沖水、脫水、透明、包埋切片和蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin.HE)染色。每組選取3個樣品切片，低倍鏡下(4X)每張切片選出5個典型的視野觀察腸黏膜形態，觀察過程中應注意所選取的腸絨毛長度應該基本一致，通過正置顯微鏡進行拍照。運用軟件 Image-J測量絨毛的高度、隱窩的深度，并計算出絨隱比。

1.2.6 測序  將采集的十二指腸、直腸內容物送往上海美吉生物醫藥科技有限公司測序,通過美吉生物云平臺對測序結果進行交互分析。

1.2.7 數據整理與分析  先通過 Excel2016 對初始數據進行整理，然后對斷奶仔豬生長性能和腸道結構影響部分,結果通過 SPSS 19.0 統計軟件進行 t 檢驗，以最小顯著性差異法(least-significant differ-ence,LSD)進行多重比較，結果均以平均值 ± 標準誤(Mean ± SE)表示；對斷奶仔豬菌群結構影響部分，結果進行 Wilcoxon 秩和檢驗，結果均以平均值士標準差(Mean ± SD) 表示。以 P<0.05 表示差異顯著。

2.1 植物精油對仔豬生產性能的影響

由表 1可知，與對照組相比，試驗組仔豬 ADG、ADFI均顯著高于對照組(P＜0.05)，仔豬腹瀉率顯著低于對照組(P<0.05)，F/G 低于對照組。